使用ABI 7500實時熒光定量PCR儀時，需注意以下關鍵事項以確保實驗的準確性和設備的安全運行：

一、abi7500 pcr實驗前準備

1、樣本與試劑

使用高質(zhì)量、無污染的DNA/RNA模板和試劑（如引物、探針、Master Mix）。

避免試劑反復凍融，分裝保存以減少降解風險。

對RNA樣本進行DNase處理，并確保cDNA合成質(zhì)量。

2、耗材選擇

使用光學級八聯(lián)管或96孔板，確保與儀器適配（如ABI認證耗材）。

檢查管蓋是否密封，避免蒸發(fā)污染或信號干擾。

3、實驗設計

設置陰性對照（無模板對照，NTC）和陽性對照，監(jiān)測污染和擴增效率。

合理設計復孔（建議至少3個技術重復）以提高數(shù)據(jù)可靠性。

二、abi7500 pcr操作注意事項

1、校準與維護

定期進行 ROX校準（針對染料校正）和 光學校準（確保熒光信號穩(wěn)定性）。

清潔樣品槽和光學部件，避免灰塵或污染物干擾熒光檢測。

2、程序設置

確認反應程序（變性、退火、延伸溫度和時間）與引物/探針匹配。

設置正確的熒光通道（如FAM、VIC、ROX等），避免信號串擾。

3、加樣與上機

加樣時避免氣泡（可能影響熒光讀取），離心后再上機。

確保反應板/管在樣品槽中放置平整，避免孔位偏移。

三、數(shù)據(jù)分析與質(zhì)控

1、基線閾值設置

手動調(diào)整基線（Baseline）和閾值（Threshold），確保Ct值準確。

檢查擴增曲線是否平滑，排除異常孔（如起峰過早或非特異性擴增）。

2、熔解曲線分析（若適用）

確認單峰特異性，多峰可能提示引物二聚體或污染。

3、效率評估

標準曲線斜率應在 -3.1~-3.6 之間（對應擴增效率90%~110%）。

四、安全與維護

1、防污染措施

分區(qū)操作（試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增區(qū)），使用帶濾芯槍頭。

定期用10%漂白劑或乙醇清潔工作臺。

2、儀器保養(yǎng)

關機前清潔樣品槽，定期聯(lián)系工程師進行專業(yè)維護。

避免長時間連續(xù)運行，防止過熱。

通過嚴格遵循上述步驟，可減少實驗誤差，確保熒光定量PCR結(jié)果的可靠性和重復性。如遇異常問題，建議參考儀器手冊或聯(lián)系ABI技術支持。