伯樂(lè)Bio-Rad CFX Opus 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的正確操作使用方法。這是一份詳細(xì)的、分步驟的操作指南，旨在幫助您安全、準(zhǔn)確、高效地使用該儀器。

一、伯樂(lè)CX OPUS96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1、儀器準(zhǔn)備

開(kāi)機(jī)：打開(kāi)儀器主機(jī)電源，再打開(kāi)電腦。啟動(dòng) CFX Maestro 軟件。儀器會(huì)進(jìn)行自檢，確保所有指示燈正常。

預(yù)熱：儀器開(kāi)機(jī)后預(yù)熱10-15分鐘，使光學(xué)系統(tǒng)和加熱模塊穩(wěn)定。

2、軟件準(zhǔn)備

在電腦上雙擊打開(kāi) CFX Maestro 軟件。

創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)：點(diǎn)擊 New Experiment 或 Create Experiment。

3、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

明確您的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模憾俊⑾鄬?duì)定量（基因表達(dá)分析）、基因分型等。

設(shè)計(jì)好您的實(shí)驗(yàn)布局（板布局），包括：

待測(cè)樣品：每個(gè)樣品設(shè)置技術(shù)重復(fù)（通常2-3個(gè)）。

標(biāo)準(zhǔn)品（用于定量）：一系列已知濃度的DNA/cDNA，用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

陰性對(duì)照：

無(wú)模板對(duì)照：反應(yīng)體系中不加任何模板，用于檢測(cè)試劑或環(huán)境是否存在污染。

無(wú)逆轉(zhuǎn)錄對(duì)照：僅用于基因表達(dá)分析，檢測(cè)基因組DNA污染。

內(nèi)參基因（用于相對(duì)定量）：用于校正樣品間的加樣量和RNA質(zhì)量差異。

4、反應(yīng)體系配制（在冰上或冷卻板上操作）

根據(jù)您的試劑盒說(shuō)明書(shū)或自行優(yōu)化的方案，計(jì)算并配制 主混合液。

推薦配制順序：在一個(gè)1.5 mL無(wú)菌無(wú)核酸酶離心管中，按以下順序加入：

無(wú)核酸酶水

PCR緩沖液、Mg2?等

dNTPs

引物 和 探針（如使用）

熱啟動(dòng)DNA聚合酶（最后加入，避免室溫下非特異性擴(kuò)增）

充分混勻并短暫離心。

將主混合液分裝到PCR板或八聯(lián)管中。

最后在指定的模板添加區(qū)加入模板DNA/cDNA，蓋上管蓋/板膜。

短暫離心PCR板/八聯(lián)管，確保所有液體沉于管底且無(wú)氣泡。

二、伯樂(lè)CFX OPUS96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上機(jī)操作流程

1、步驟1：放置樣品

打開(kāi)儀器的樣品槽門(mén)。

如果是96孔板：將其平穩(wěn)地放入樣品槽中，確保板子放置平整，A1孔位于左上角。

如果是八聯(lián)管：確保所有管子擺放整齊，卡在支架上，位置正確。

輕柔地關(guān)上樣品槽門(mén)。

2、步驟2：在CFX Maestro軟件中設(shè)置實(shí)驗(yàn)

（1）選擇檢測(cè)類(lèi)型：

點(diǎn)擊 Assay -> Select。

對(duì)于SYBR Green I染料：選擇 SYBR® Green。

對(duì)于TaqMan探針：選擇 FAM 或其他相應(yīng)的熒光染料。

對(duì)于HRM分析：選擇 HRM。

（2）設(shè)置板布局：

在虛擬的96孔板界面上，用鼠標(biāo)拖動(dòng)選擇孔位。

為選中的孔位指定 樣品名稱(chēng) 和 任務(wù)。

任務(wù)類(lèi)型包括：

Unknown：未知樣品。

Standard：標(biāo)準(zhǔn)品，并需要輸入其濃度。

NTC：無(wú)模板對(duì)照。

Positive Control：陽(yáng)性對(duì)照。

（3）編輯實(shí)驗(yàn)協(xié)議：

點(diǎn)擊 Protocol 進(jìn)入編輯界面。一個(gè)典型的qPCR程序包括三個(gè)階段：

a. 預(yù)變性/熱啟動(dòng)：

溫度：95°C

時(shí)間：2-5分鐘（根據(jù)酶的要求，激活熱啟動(dòng)酶并確保模板變性）。

b. 擴(kuò)增循環(huán)（重復(fù)40-45個(gè)循環(huán)）：

變性：95°C，10-30秒。

退火/延伸：60°C（常用），30-60秒。在此步驟采集熒光信號(hào)。

注意：如果引物Tm值較低，可能需要分開(kāi)設(shè)置退火和延伸步驟。

c. 熔解曲線分析（僅適用于SYBR Green I）：

儀器會(huì)自動(dòng)生成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線程序，通常為：

95°C，10秒

65°C，5秒

然后從65°C緩慢升溫到95°C，每0.5°C采集一次熒光信號(hào)。

3、步驟3：?jiǎn)?dòng)運(yùn)行

保存實(shí)驗(yàn)文件：為您的實(shí)驗(yàn)命名并保存（.pcrd 文件）。

點(diǎn)擊 Start Run。

軟件會(huì)彈出一個(gè)對(duì)話框，讓您再次確認(rèn)板布局和實(shí)驗(yàn)協(xié)議。確認(rèn)無(wú)誤后，點(diǎn)擊 開(kāi)始。

儀器將開(kāi)始運(yùn)行，您可以在軟件界面上實(shí)時(shí)查看反應(yīng)進(jìn)程、擴(kuò)增曲線和溫度狀態(tài)。

三、伯樂(lè)CFX OPUS96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀運(yùn)行后數(shù)據(jù)分析

1、查看擴(kuò)增曲線：

確保所有陽(yáng)性樣品的擴(kuò)增曲線呈標(biāo)準(zhǔn)的“S"型，基線平穩(wěn)，指數(shù)期明顯。

檢查NTC對(duì)照是否有擴(kuò)增信號(hào)（應(yīng)無(wú)或Ct值>35），如有則表明存在污染。

2、查看熔解曲線（SYBR Green I）：

確保每個(gè)樣品只有一個(gè)單一的、尖銳的峰。出現(xiàn)多個(gè)峰或?qū)挿灞砻饔幸锒垠w或非特異性擴(kuò)增。

3、進(jìn)行定量分析：

定量：軟件會(huì)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2 > 0.99，效率在90%-110%之間為佳），并計(jì)算出未知樣品的起始拷貝數(shù)或濃度。

相對(duì)定量（ΔΔCt法）：

軟件會(huì)先計(jì)算每個(gè)樣品的內(nèi)參基因（管家基因）和目標(biāo)基因的Ct值。

然后通過(guò) ΔCt = Ct(目標(biāo)基因) - Ct(內(nèi)參基因)，ΔΔCt = ΔCt(實(shí)驗(yàn)組) - ΔΔCt(對(duì)照組)，最終計(jì)算出 2^(-ΔΔCt)，即基因表達(dá)的相對(duì)倍數(shù)變化。

4、導(dǎo)出數(shù)據(jù)：可以將圖表和數(shù)據(jù)（如Ct值、濃度等）導(dǎo)出為Excel或PDF格式，用于報(bào)告和存檔。