伯樂（Bio-Rad）的CFX系列實時熒光定量PCR儀，包括經典的CFX96/384以及您提到的CFX Duet，是應用非常廣泛的qPCR平臺。它支持主流的全部檢測化學方法。對于在CFX Duet上進行實驗，常用的染料主要分為兩大類：非特異性染料（SYBR Green）和特異性探針（如TaqMan等）。

一、伯樂CFX DUET實時熒光定量PCR儀SYBR Green 染料法

1、通用型：

（1）SYBR® Green I： 黃金標準。幾乎所有品牌的SYBR Green qPCR預混液（Master Mix）都基于此染料。Bio-Rad自家也提供SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix 等明星產品，特點是含有高保真、熱啟動的Sso7d融合酶，特異性高，可防止引物二聚體的干擾。

（2）常用品牌： Bio-Rad、Takara、Thermo Fisher、Qiagen、NEB等公司的SYBR預混液均可兼容。

2、增強型/高特異性型：

（1）一些預混液中會添加特殊成分（如熒光染料、抗體或修飾酶）來進一步提高特異性和信噪比。

（2）例如： EvaGreen® 也是一種常見的DNA結合染料，其飽和濃度更高，在某些應用中可能比SYBR Green I更穩定。CFX Duet同樣兼容。

3、何時選擇？

基因表達分析（相對定量）。

基因型篩選、熔解曲線分析。

當需要快速優化或檢測多個靶點時（成本低，只需設計引物）。

二、伯樂CFX DUET實時熒光定量PCR儀特異性探針法

1、TaqMan® 水解探針（最主流）：

（1）探針5‘端帶報告熒光基團（如FAM），3’端帶淬滅基團（如TAMRA, BHQ）。PCR延伸時，Taq酶的水解活性將探針切斷，報告基團與淬滅基團分離，產生熒光。

（2）CFX Duet兼容所有TaqMan探針檢測。儀器預設了常見熒光基團（如FAM, HEX/VIC, CY5, ROX等）的檢測通道。

（3）常用試劑： Bio-Rad的SsoAdvanced™ Universal Probes Supermix， 或TaqMan™ Universal Master Mix II（來自Thermo Fisher）等。

2、分子信標：

（1）莖環結構的探針，在結合靶序列后構象改變，使熒光基團和淬滅基團分離而發光。特異性也非常高。

（2）同樣兼容CFX Duet。

3、FRET雜交探針（如用于基因分型的探針）：

（1）使用兩個相鄰的探針，一個帶供體熒光基團，一個帶受體熒光基團。當兩者靠近時發生能量轉移。適用于高分辨率熔解曲線分析。

（2）在一些特殊的SNP分型應用中使用。

4、何時選擇？

定量（如病毒載量檢測）。

多基因同時檢測（多重PCR）。

特異性要求高的應用（如區分同源序列）。

SNP分型。

三、 高分辨率熔解曲線染料

這類染料飽和結合DNA，可用于區分序列差異（如SNP、突變檢測），通常不與SYBR Green混用。

LCGreen®, SYTO®9 等。

在CFX Duet上運行后，通過其精確的溫控和熒光采集功能進行高分辨率熔解曲線分析。

四、操作建議：

1、確定實驗目的： 是看表達量（相對定量）還是精確拷貝數（定量）？是否需要區分非常相似的序列？

2、根據目的選擇化學方法： 大部分表達分析用SYBR Green即可；病毒檢測、多重檢測用TaqMan探針。

3、選擇成熟的商業預混液： 對于新手和常規實驗，強烈建議購買包含熱啟動酶、dNTPs、Mg2?、優化緩沖液和染料的2× qPCR Master Mix。這是簡單可靠的方式。

SYBR法： 可選用 Bio-Rad SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix。

探針法： 可選用 Bio-Rad SsoAdvanced Universal Probes Supermix。

4、在CFX Duet軟件中正確設置：

選擇正確的檢測化學（“SYBR" 或 “TaqMan"）。

選擇正確的熒光通道（SYBR用FAM通道；TaqMan根據探針報告基團選擇FAM、HEX、CY5等）。

關鍵： 選擇與您所用預混液匹配的被動參考染料（通常是ROX）。這一步設置錯誤會導致數據異常。

總之，伯樂CFX Duet是一款功能全面的儀器，支持市場上幾乎所有主流的qPCR染料和化學方法。您只需要根據實驗需求進行選擇，并在軟件中做好對應設置即可。