使用賽默飛Simpliamp梯度PCR儀進行實驗時所需的耗材和試劑。這是一套標準而完整的清單，您可以根據您的具體實驗方案進行選擇和調整。

一、賽默飛Simpliamp梯度PCR儀核心耗材

這些是直接放入PCR儀的消耗品。

1、PCR管或PCR板

（1）類型：必須使用透明、無裙邊或半裙邊的96孔PCR板或0.2ml單管/8聯管。Simpliamp的熱蓋是平板式設計，與平蓋的板/管才能緊密接觸，確保熱封效果。

（2）材質：推薦使用高質量、超薄壁的聚丙烯管/板，以確保熱傳導效率和溫度準確性。

（3）重要提示：切勿使用有高高凸起管蓋的PCR管（如某些品牌的單管），否則熱蓋無法壓緊，會導致反應體系蒸發和實驗失敗。

2、封板膜或管蓋

（1）對于PCR板：使用光學透明的粘性封板膜，確保密封嚴實，防止蒸發和交叉污染。

（2）對于單管/八聯管：確保管蓋蓋緊。八聯管通常有配套的平蓋。

二、賽默飛Simpliamp梯度PCR儀核心試劑

這些是構成PCR反應體系的化學成分。

1、PCR主混合物

（1）預混液：常用且方便的是 2× PCR Master Mix。它已經包含了Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl?以及優化的緩沖液。您只需加入模板、引物和水即可。賽默飛自家的 Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix 或 DreamTaq™ Hot Start PCR Master Mix 都是兼容性很好的選擇。

（2）單獨組分：也可以選擇單獨購買：熱啟動Taq DNA聚合酶、10× PCR緩沖液、dNTP混合物、MgCl?溶液。

2、引物

上游引物和下游引物：針對您目標基因特異性設計的寡核苷酸引物。通常使用濃度為10 μM的工作液。

3、模板DNA

可以是基因組DNA、cDNA、質粒DNA等，濃度和純度需根據實驗優化。

4、無菌無核酸酶水

用于補足反應體系體積。至關重要，必須確保無菌且無核酸酶污染，以防止降解和假陰性結果。

三、實驗流程簡要總結（以使用預混液為例）

1、在冰上配制反應體系（以下為25μL體系的常見比例）：

2× PCR Master Mix：12.5 μL

上游引物（10 μM）：1.0 μL

下游引物（10 μM）：1.0 μL

模板DNA：X μL（通常10pg - 100ng，需優化）

無菌無核酸酶水：補足至 25 μL

2、輕柔混勻并短暫離心，確保所有液體收集在管底。

3、將PCR管/板放入Simpliamp儀器中，確保放置平穩。

4、在儀器控制面板或配套軟件上設置程序：

預變性：94-98°C，30秒 - 2分鐘。

循環（30-40次）：

變性：94-98°C，10-30秒。

退火：在此設置梯度溫度（例如50°C - 65°C），這是Simpliamp梯度功能的關鍵應用，用于快速確定退火溫度。15-60秒。

延伸：72°C（對于Taq酶），每1kb延伸30-60秒。5-10分鐘。保溫：4-10°C。

5、啟動運行。

6、程序結束后，取出產物，進行后續的電泳或分析。

梯度功能：Simpliamp的核心優勢是可以在同一塊板/同一批管子上同時測試多個退火溫度。在設置時，您只需要在退火步驟設置一個溫度范圍，儀器會自動在加熱塊的不同列生成線性梯度。放置樣品時，請根據儀器說明書或屏幕提示，將樣品放在對應的列上。

清潔與維護：定期用70%乙醇擦拭熱蓋和樣品槽，防止污染。